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作者：

朱光

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摘要：

研究背景:宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均高居女性恶性肿瘤第四位,严重危害女性健康.目前,以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)为代表的靶向药物及以细胞程序性死亡受体(programmed cell deathprotein 1,PD-1)为代表的免疫抑制剂等,是宫颈癌新兴的治疗策略.但研究表明,两者均存在较大的治疗风险和脱靶效应,且免疫制剂的治疗范围有限.因此,寻找有效生物标志物对宫颈癌患者的诊疗具有重要的临床意义.有氧糖酵解,又名"瓦博格效应",主要表现为细胞葡萄糖摄取率的升高,糖酵解活跃,代谢产物中乳酸含量升高.近期研究表明,肿瘤细胞会关闭线粒体的有氧氧化途径,不论在有氧还是无氧条件下均主要依赖糖酵解途径来获取能量.目前有氧糖酵解作为肿瘤的一个普遍代谢方式被广泛认可,一些靶向有氧糖酵解,抑制肿瘤进展的相关药物已投入临床应用.十余种参与调控糖酵解蛋白酶的编码基因也一度成为科学家们的研究热点.NAD(P)H 醌氧化还原酶 1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)是一种黄素酶,作为一种催化醌类及相关分子的多功能蛋白,在降低外源性醌类化合物毒性和氧化还原平衡中发挥重要作用.NQO1的等位基因C609T突变导致肿瘤抑制蛋白p53稳定性降低,增加患癌风险.有研究表明,NQO1通过介导有氧糖酵解,谷氨酰胺代谢和脂代谢等能量代谢参与调控多种肿瘤的增殖,转移等生物学过程.本课题组前期研究发现,NQO1在宫颈癌组织中的高表达提示患者的不良预后,但关于NQO1高表达对宫颈癌生物学进程的影响及其涉及的相关机制则鲜有报道.缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)在低氧情况下转录增加,常高表达于增殖迅速且长期处于缺氧状态的肿瘤细胞,HIF1α的高表达可以促进糖酵解相关蛋白的表达和活性,使得肿瘤细胞的糖酵解水平异常旺盛.同源异型盒基因SIX1在胚胎发育中起关键性作用,且在宫颈癌中高表达,近期研究指出SIX1在低氧环境下促进乳腺癌糖酵解,但NQO1与HIF1α/SIX1是否参与调节宫颈癌的有氧糖酵解,这两者之间是否存在相互调控关系仍有待进一步研究.研究目的:初步阐明NQO1在调控宫颈癌有氧糖酵解及恶性演进中的功能和相关分子机制:(1)明确NQO1在宫颈癌恶性进展中的分子标志物作用;(2)探究NQO1在宫颈癌细胞增殖,转移和有氧糖酵解等生物学功能中的作用;(3)揭示NQO1与HIF1α之间的调控关系,阐明NQO1调控宫颈癌有氧糖酵解及其恶性进展的分子机制.材料与方法:(1)宫颈癌组织样本及数据库相关性分析:1)通过GEPIA,Human Protein Atlas(HPA),cBioPortal 和 CCLE 等生物学信息库检索 NQO1 在泛癌和宫颈癌组织及细胞中的表达;2)采用免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹实验检测NQO1在宫颈癌组织及细胞中的表达情况,分析NQO1的高表达与宫颈癌患者临床病理学参数之间的关系;(2)体外实验:1)应用慢病毒转染,构建高表达和敲降NQO1的稳转细胞系;2)应用MTT,平板克隆等实验确定NQO1对宫颈癌细胞增殖能力的影响;3)应用流式细胞术和蛋白免疫印迹实验检测NQO1对宫颈癌细胞凋亡情况的影响和调控作用;4)应用划痕实验和Transwell小室实验确定NQO1对宫颈癌细胞转移和侵袭能力的影响;5)应用免疫荧光染色(immunofluorescent staining,IF staining)和蛋白免疫印迹实验检测NQO1对宫颈癌细胞EMT进程的影响;6)应用试剂盒和海马代谢产物测定仪测定NQO1在宫颈癌有氧糖酵解中的调控作用;7)利用糖酵解抑制剂抑制,葡萄糖刺激等实,双向验证NQO1在宫颈癌有氧糖酵解中的调控作用;8)利用氯化钴(CoCl2),放线菌酮(CHX)蛋白合成抑制剂,MG132蛋白酶体抑制剂和泛素化相关实验检测NQO1在HIF1α蛋白泛素化降解中的调控作用;9)应用小干扰RNA,蛋白免疫印迹实验,代谢产物测定实验探究NQO1下游因子HIF1α/SIX1在宫颈癌有氧糖酵解,增殖和转移中的作用及调控机制.(3)体内实验:建立裸鼠皮下荷瘤模型,尾静脉注射肺转移瘤模型,明确NQO1对宫颈癌细胞增殖,转移的影响.结果:第一部分:NQO1在宫颈癌组织中高表达,且与宫颈癌恶性演进相关:1)生信分析结果显示NQO1在宫颈癌组织和细胞中高表达.2)IHC实验显示NQO1在宫颈癌组织中高表达,且与宫颈癌的恶性进展密切相关.3)通过MTT,克隆形成等实验发现NQO1过表达可促进宫颈癌细胞增殖.4)通过蛋白免疫印迹,流式细胞术等实验发现NQO1过表达可抑制宫颈癌细胞凋亡.5)通过划痕和迁移小室实验发现,NQO1过表达可促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭.6)通过EMT相关蛋白免疫印迹检测和IF发现,NQO1过表达可促进宫颈癌上皮-间质转化进程.第二部分:NQO1在宫颈癌糖酵解中的作用:1)通过富集分析,代谢产物的测定及糖酵解相关蛋白的蛋白免疫印迹测定发现,NQO1增加宫颈癌细胞的有氧糖酵解水平,并促进宫颈癌的增殖和转移.2)通过AMPK信号通路相关蛋白的蛋白免疫印迹测定,发现NQO1可以降低宫颈癌细胞内活性氧生成,并抑制AMPK相关信号通路的激活.第三部分:NOO1通过HIF1α/SIX1调节宫颈癌的有氧糖酵解:1)通过小干扰RNA敲降HIF1α,CoCl2诱导,测定宫颈癌细胞有氧糖酵解相关产物及增殖,转移等相关表型的变化等实验,发现NQO1通过HIF1α调节宫颈癌细胞的有氧糖酵解水平及恶性进展.2)运用Co-IP实验,荧光免疫共定位染色及泛素化等实验发现,NQO1与HIF1α相结合,且NQO1通过抑制蛋白酶体对HIF1α的泛素化降解,进而增加HIF1α的稳定性.3)免疫组织化学染色发现SIX1在宫颈癌组织中高表达,敲降SIX1可有效降低宫颈癌细胞的有氧糖酵解水平和恶性进展.结论:NQO1和SIX1在宫颈癌组织中的高表达与宫颈癌的恶性演进密切相关,且NQO1可抑制AMPK信号通路,通过促进HIF1α/SIX1的表达,调控宫颈癌细胞的有氧糖酵解,增殖和转移.

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学位级别：

博士